阿魏酸等五种酚类物质对DNA氧化损伤的影响

　　流行病学调查显示使用大量的抗氧化食物可以减少许多慢性疾病的发病率[1，2]。而酚类物质因为广泛存在人类和动物所食用的植物之中，虽然没有营养作用，但因为他们拥有抗氧化、抗畸变、抗癌变、抗炎的活性，已成为自由基领域的研究热点。关于酚类物质的抗氧化活性人们已经研究了许多，但是以它们作为干涉因素的试验并没有清楚地显示其保护效果，而一些试验却已报道它们具有氧化增强作用。我们实验选取五种结构上相似的酚类物质阿魏酸、咖啡酸、香草酸、阿司匹林(乙酰水杨酸)和水杨酸(其化学结构见图1)作为研究对象对其可能的抗氧化或氧化增强作用进行了研究。

　　单细胞凝胶电泳(Single Cell Gel Eletrophoresis，SCGE)，又名彗星电泳(Comet Assay，CA)，是一种新近发展起来非常简单、快速、敏感的可以观测单个细胞DNA损伤的方法。我们的实验目的就是通过彗星电泳法检测出阿魏酸等五种酚类物质的抗氧化特性，并就其分子结构连同实验数据共同分析，希望就其构效关系寻找一些规律，为酚类物质的分子改造奠定一些基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　五种酚类物质对H2O2所致DNA损伤的保护作用

　　1.1.1　淋巴细胞的分离、收集 取正常人外周血5 ml，肝素钠抗凝，用 PBS按1:1稀释，混匀后，注入到装有淋巴细胞分离液的离心管中，离心20 min(720×g，20 ℃)，淋巴细胞层悬浮于分离液之上，吸出淋巴细胞，用4℃预冷的PBS清洗2次。

　　1.1.2　药物作用　取细胞悬液分别与各浓度组被检药物溶液(50 μmol/L，100 μmol/L，500 μmol/L)混合，阴性对照加PBS、阳性对照只加H2O2，37 ℃温箱中共同孵育30 min。PBS清洗2次。

　　1.1.3　H2O2作用　取终浓度为40 μmol/L H2O2与各药物浓度组及阳性对照组细胞悬液混合，阴性对照组只加PBS，4 ℃冰箱中作用10 min。PBS清洗3次。

　　1.1.4　单细胞凝胶电泳　参照Singh等[3]的方法，在完全磨砂载玻片上用85 μl 1%正常熔点的琼脂糖(不含Ca2+, Mg2+，50 ℃)铺片，盖上盖玻片，置 4 ℃冰箱10 min，至凝;移去盖玻片，将细胞悬液与1%低熔点琼脂糖(37 ℃)按1:1混合, 共70 μl作为第二层，盖上盖玻片，4 ℃冰箱放置10 min，至凝;移开盖玻片，将75 μl 0.5%低熔点琼脂糖(37 ℃)作为第三层， 4 ℃冰箱放置10 min，至凝。移去盖玻片，将载玻片浸泡在4 ℃预冷的裂解液中(2.5 mol/L NaCl,100 mmol/L Na2EDTA, 10 mmol/L Tris缓冲液，1% 十二烷基肌氨酸钠，pH 10，用前加终浓度为1% Triton-100和10% DMSO)，2 h后将载玻片从裂解液中移出，用电泳液冲洗后并列放在水平板电泳槽中，电泳槽中盛有新鲜配制的预冷的电泳液(1 mmol/L Na2EDTA,300 mmol/L NaOH)约覆过载玻片0.25 cm，放置20 min，使DNA解螺旋。室温下电泳20 min(电压1 V/cm，电流300 mA)。电泳后用0.4 mol/L Tris pH 7.5浸洗3次，每次 10 min。

　　1.1.5　染色　用5 μg/ml EB 40 μl染色，染色后立即用倒置荧光显微镜(10×20)下进行观察、照相, 激光波长515～560 nm, 阻断波长>590 nm。

　　1.1.6　测量　每个实验组随机抽取20个细胞，对彗星尾距(尾部DNA占总DNA的百分比与尾长的乘积)进行测量。

　　1.2　高浓度组咖啡酸、阿司匹林、水杨酸对DNA损伤的影响　淋巴细胞经分离和清洗后，取细胞悬液与咖啡酸(500 μmol/L)、阿司匹林(500 μmol/L)、水杨酸(500 μmol/L)混合，于37 ℃温箱中共同孵育30 min;PBS清洗2次，离心10 min(180 g， 4 ℃)后;进行单细胞凝胶电泳，测量，统计。

　　1.3　统计学方法　使用SPSS 10.0统计软件， 各组之间均数比较使用ANOVA ，选定α=0.05作为检验水准。

　　2　结　果

　　外周血淋巴细胞用40 μmol/L H2O2作用10 min后，引起DNA明显断裂。于37 ℃温箱中预先用待测药物与细胞共同孵育30 min后，彗星尾距都有不同程度地减小(表1)。其中阿魏酸和香草酸对DNA的保护作用最为明显，3个浓度组与阳性对照相比差异均有统计学意义，而且随着作用浓度的增加，彗星尾距有减小的趋势。而咖啡酸、阿司匹林、水杨酸在高浓度(500 μmol/L)时，虽然对DNA仍有保护作用，但与低浓度组(50 μmol/L、100 μmol/L)相比，彗星尾距反而有所增加，尤其以咖啡酸最为明显。

　　图2为咖啡酸(500 μmol/L)、阿司匹林(500 μmol/L)和水杨酸(500 μmol/L)与淋巴细胞共同孵育 30 min(37 ℃)，未经H2O2处理，彗星电泳后观察到的DNA损伤情况。从图中可看出与对照组相比，经咖啡酸作用后的彗星尾距显著增加(P<0.05)，而经阿司匹林和水杨酸作用后的彗星尾距虽有增加，但与对照组之间差异无统计学意义。

　　3　讨　论

　　许多流行病学调查都已表明大量植物酚的摄入与减少心血管疾病和肿瘤的发病率相关[4，5]。然而酚类化合物的抗氧化机制尚未完全清楚，而且一些酚类化合物在研究过程中并未表现出抗氧化作用，而是氧化增强作用。

　　在本实验中，咖啡酸在浓度为50～500 μmol/L之间，对DNA都有不同程度的保护作用，浓度为 50 μmol/L时彗星尾距与阳性对照组之间差异无统计学意义，说明其保护作用并不明显;当浓度为100 μmol/L时，彗星尾距与阳性对照差异有统计学意义，证明其有保护作用;当浓度达到500 μmol/L时，彗星尾距反而较前2个浓度组有所增加，与100 μmol/L浓度组之间差异有统计学意义，而与阳性对照组之间差异无统计学意义。据报道一杯新鲜的咖啡在开放的培养皿中37 ℃下培养导致H2O2时间依赖性的升高，培养一个小时H2O2升至(390±70) μmol/L[6]。事实上，咖啡中的一些物质包括咖啡酸在存有氧和过渡金属离子如Fe2+、Mn2+和Cu2+的条件下可自动氧化而产生H2O2[7]。为了证明咖啡酸在高浓度时，具有损伤DNA的作用，本实验采取只用咖啡酸对细胞进行预处理，而不用H2O2作用的方法，彗星电泳后发现彗星尾距较阴性对照组明显增加，二者之间差异有统计学意义，证明高浓度组咖啡酸确有DNA损伤作用。因此我们设想咖啡酸可能一方面通过清除自由基等作用来保护DNA，另一方面它还可以产生H2O2，导致DNA损伤，这两种作用同时存在。当存在有氧化活性更强的物质时，咖啡酸主要显示了保护作用，这种保护作用并非与药物浓度呈正相关，低浓度时咖啡酸的保护作用随作用浓度增加而增加，高浓度时咖啡酸产生的H2O2增加，部分抵消了它的保护作用，在浓度不断增加的情况下，甚至可以导致DNA的损伤。

　　本试验中，阿魏酸在浓度为50～500 μmol/L之间对DNA都有保护作用，虽然各浓度组之间差异没有显著性，但是尾距有随阿魏酸浓度增加而减小的趋势。阿魏酸存在于众多的中草药中，如：当归、川芎、丹参、鼠尾草、咖啡豆等，众多研究显示它对预防和治疗心血管疾病十分有效。以往虽然有不少关于阿魏酸的抗氧化活性的报道，但是本实验时第一次使用彗星电泳法研究在细胞水平阿魏酸对DNA的保护作用，从本实验中可以看出阿魏酸有较强的抗氧化保护DNA的作用。阿魏酸之所以有较强的抗氧化活性，是多种机制共同作用的结果。阿魏酸的自由基清除能力与其分子结构密切相关，自由基与阿魏酸相撞后，很容易从其上面夺取一个氢原子而形成苯氧自由基，由于未配对电子不仅可以存在于氧原子上，还可以存在于整个分子的任何部位，同时借助-OCH3可以形成p型弧对电子，因而阿魏酸形成的苯氧自由基相对稳定，而且当两个苯氧自由基相撞时，可以结合形成姜黄素，从而减慢和终止自由基链式反应的进程。有实验显示将p-香豆酸甲氧基化形成阿魏酸在一定程度上降低了苯氧自由基的稳定性，因而抗氧化能力也有所降低。乙酰化阿魏酸可以明显降低它的抗氧化能力[8]，这些都证明了它是通过形成稳定的苯氧自由基从而终止自由基链式反应来实现抗氧化的。然而阿魏酸具有-CH=CHCOOH基团，具有吸电子作用，本不利于苯氧自由基的稳定，但考虑到阿魏酸在溶液中显酸性，因此一部分将以负离子形式存在，而-CH=CHCOO-具有强推电子性质，使其抗氧化活性增强[9]。

　　我们实验显示各种浓度组的阿司匹林和水杨酸对DNA都有保护作用，各浓度组浓度与阳性对照之间都存在显著差异，当浓度为500 μmol/L时其尾距较低浓度组有所增加，但差异无统计学意义。可能与较高浓度时，它们产生较多的活性氧有关。这种效果与咖啡酸有些相似，可能产生的H2O2较少，所以损伤效果没有那么明显。本实验接着采取只用阿司匹林和水杨酸对细胞进行预处理，而不用H2O2作用的方法，彗星电泳后发现彗星尾距与阴性对照组相比没有显著变化。由于这是第一次利用彗星电泳法在细胞水平研究阿司匹林和水杨酸抗氧化保护DNA的作用，而且也没有关于它们产生H2O2、的研究，所以其在高浓度时彗星尾距较低浓度组略有增加的具体机制还需要进一步研究。本实验显示阿司匹林和水杨酸具有较强的抗氧化保护DNA的作用，长期以来二者一直作为消炎止痛药而广泛应用于临床，进来的研究主要集中于它们的抗氧化特性。据报道长时间的使用阿司匹林可以防止结肠癌和其他消化道肿瘤包括食管癌和胃癌[10]。已证明阿司匹林和水杨酸具有清除·OH自由基的作用，浓度为0.5～2 mmol/L的阿司匹林可以阻止H2O2、Cu2+和HQ、Cu2+诱导的DNA损伤，而对于H2O2 没有清除作用[3,4]。但是Qiao等[11]用彗星电泳法证明阿司匹林诱导HT-29细胞系凋亡时发现：用 3 mmol/L阿司匹林作用72 h后，可以导致DNA的明显断裂损伤，此实验结果可能与本实验中阿司匹林和水杨酸高浓度组彗星尾距较低浓度组有所增加相关。

　　关于香草酸的研究非常少，但是其在结构上与阿魏酸与咖啡酸在结构上极其相似，而且它们三者之间又可以作为彼此的代谢物而存在于体内。本实验发现香草酸对DNA亦有保护作用，而且也有随剂量增加而加强的趋势，虽然统计学上各浓度组之间差异无统计学意义。从结构上来看，香草酸和阿魏酸与咖啡酸的不同之处，主要在于咖啡酸在邻位存在一个-OH，仅能抑制超氧阴离子所致的脂质过氧化，而前两者在邻位存在一个-OCH3，这可能是咖啡酸与前两者效果不同的主要原因。从彗星尾距上来看，阿魏酸较香草酸的DNA保护效果稍微有差别，这是其在对位存在-CH=CHCOOH的结果，说明对位的-CH=CHCOOH较-COOH可以更有效的增强苯氧自由基的稳定性。

　　综上，上述5种酚类物质均表现出了一定的保护DNA抗氧化活性，其中以咖啡酸保护DNA的作用最弱，可能与其邻位的酚-OH以及产生较多的H2O2相关，而且咖啡酸单独与细胞作用时，可以产生DNA断裂损伤;阿司匹林和水杨酸在高浓度组其尾距较低浓度组又有所回升，虽然其具体机制尚未完全明确，但也可能与产生H2O2相关，而且信号传导通路以及基因调控也可能参与到其中;阿魏酸和香草酸的效果较好，可能与其邻位的-OCH3相关。

（实习编辑：王京鑫）

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